IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导和类器官培养。本文将重点探讨第一阶段——人多能干细胞的培养。

实验准备

1. **人多能干细胞培养基的配制** （1）将hPSC Medium Supplement在2-8℃下解冻，融化后轻轻摇动均匀，依据实际需求分装，使用后可储存于-20~-80℃，避免反复冻融。 （2）将10mL hPSC Medium Supplement以1:50的比例加入500mL hPSC Medium Basal Medium，充分混合即可形成人多能干细胞培养基（abs9403）。注意：该培养基可在2-8℃条件下稳定存放2-3周，不建议使用超过3周的培养基。 （3）实验试剂须在使用前达到室温，PBS、消化液等需在37℃下加热。注意：切勿用37℃水浴加热培养基。

操作方法

以下步骤应在无菌条件下进行。 **hPSC细胞的复苏操作步骤：** 1. **基质胶包被培养板**：取6孔板/12孔板，每孔加入1mL/0.5mL基质胶（abs9410），轻轻晃动以确保覆盖，置于37℃培养箱中孵育1~2小时。实验前取出，放在超净工作台/生物安全柜中平衡20分钟。若暂时不使用，可用Parafilm封存后在2-8℃储存，建议在1周内使用。注意：冻存的干细胞数量约为1×10^6 cells/mL，适配于6孔板的单孔；基质胶对温度敏感，需立即放回4℃冰箱保存，不要直接触碰基质胶液面，保持其质量。 2. 先将2~3mL的干细胞培养基加入15mL离心管中备用。 3. **解冻**：将冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1~2分钟内迅速解冻。注意：从液氮取出的细胞应尽快操作，减少在室温下暴露的时间。 4. **离心**：在解冻后的冻存管中，逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管，平衡后以1000rpm离心3分钟。 5. **重悬**：离心后弃上清，加入1mL人多能干细胞培养基，进行吹吸混匀，大约3~5次。 6. **接种**：将已经均匀混合的干细胞悬液加入包被好的6孔板中，补全每孔2mL的培养体系。 7. **培养**：接种后的6孔板可在倒置相差显微镜下观察细胞状态，理想的状态是测量到4个细胞以上的团块。通过轻晃确保细胞均匀分布，放入37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，第二天观察细胞贴壁情况。 8. **换液**：从复苏开始每24小时更换培养基一次。需注意活性成分只足够维持一天，因此每24小时应及时更换新鲜的培养基。

多能干细胞的传代

**具体操作步骤：** 1. **清洗**：吸掉旧培养基后，缓慢加入1mL PBS缓冲液，轻轻摇动，然后沿皿边吸去PBS。 2. **消化**：在6孔板中加入2mL人多能干细胞消化液（abs9409），覆盖在皿底上，置于37℃培养箱中2~5分钟。消化时间需根据细胞生长密度而定，通常建议时间为2-5分钟。可以在倒置显微镜下观察消化情况，大多数克隆边缘及内部细胞间出现间隙即可吸掉消化液终止消化。 3. **吹打**：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液枪轻柔吹打皿底3~5次，使干细胞集落脱落，并转移至15mL离心管中。注意：力度要轻柔，避免形成单细胞。如果有少量细胞无法脱落属于正常现象，如大量细胞依然无法脱落，则需延长消化时间。 4. **离心**：以1000rpm离心3分钟，并弃上清。 5. **接种**：用干细胞培养基轻轻吹打细胞5-10次后，吸掉包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入培养板中，补全每孔2mL的培养体系。 6. **换液**：从传代开始每24小时换液一次，确保活性成分保持在有效范围内。

多能干细胞冻存

**具体操作步骤：** 1. **清洗、消化、吹打及离心**：步骤与传代相同。 2. **重悬**：离心后弃上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412），对细胞沉淀进行吹吸混匀，后将其转移至冻存管中。注意：冻存液要及时放回4℃冰箱。 3. **记录**：在冻存管上详细记录细胞种类、冻存时间、操作人员及细胞批次信息。 4. **-80℃冰箱冻存**：冻存管放入-80℃冰箱过夜，保持直立，切忌斜放或横放。 5. **液氮冻存**：24小时后将细胞转移至液氮中进行长期冻存。

本期推荐产品包括人多能干细胞培养基（abs9403）、消化液（abs9409）、ES/iPS细胞冻存液（abs9412）等。人生就是博-尊龙凯时品牌致力于为科研提供优质的生物医疗产品，确保您的实验顺利进行。欢迎联系以获取更多产品信息和支持。