人生就是博-尊龙凯时的冻存原理探讨

当细胞的温度降至0°C以下时，细胞脱水现象发生，细胞内可溶性物质的浓度随之升高，并可能形成冰晶。不同大小的冰晶对细胞的影响不尽相同，大冰晶往往会导致细胞膜和细胞器的损伤与破裂。这一过程将显著降低复苏细胞的存活率及其状态，因此在细胞冻存时，我们采取了两个关键措施：添加低温保护剂和实施慢冻技术。

冻存最佳时机：细胞应处于良好生长阶段，密度约为80-90％，细胞数一般在106-107/ml之间。活力不佳的细胞在冻存后的存活率会显著降低。

低温保护剂：常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），其具有良好的渗透性，使其能快速进入细胞内，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点并延缓冰冻过程。这样一来，细胞内的水分能在冻结前部分渗出细胞外，形成胞外冰晶，从而减少细胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤。

慢冻细胞技术：使用程序性降温盒可有效地缓慢冷冻细胞，从而避免大冰晶的生成。若没有程序降温设施，我们可将细胞依次放在4°C保存1小时、-20°C保存2小时、然后在-80°C过夜，大部分细胞也能适应这一过程。

冻存液配置：冻存液需提前配制并在室温下保存，避免因临时配制产生的热量影响细胞，DMSO添加到培养基中时会放热。冻存液的常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，若细胞较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤：

1. 用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍；
2. 消化细胞：加入适量胰酶，放入37°C培养箱消化（10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，注意不同细胞消化时间的差异，终止消化的标准为在显微镜下观察到80%-90%以上的细胞变圆）；
3. 待消化完成后，加入体积为胰酶两倍的完全培养基以终止消化，进行800-1000rpm的离心3-5分钟；
4. 准备好冻存管，标记日期、细胞类别、姓名及代数，离心后去掉上清，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml，转移至冻存管中；
5. 将冻存管放入程序降温盒中，-80°C过夜，随后转移至液氮中保存。

注意事项：

• 细胞在加入冻存液后应立即放入-80°C保存，避免在室温下放置过久；
• 冻存细胞在-80°C储存一般不建议超过半年，液氮中储存也不建议超过2年。

细胞冻存是生物医学领域的重要环节，掌握这些基本原理和操作步骤，可以有效提高细胞的存活率与质量，为后续研究打下坚实的基础。人生就是博-尊龙凯时致力于推动生物医学的发展，不断探索更多可能性。